Home
Wprowadzenie
Programy
Inne
  

Sporządzanie preparatów

Słownik niezrozumiałych pojęć tutaj

Badanie materiału zielnikowego z objawami chorobowymi i oznakami etiologicznymi często wykonuje się w laboratorium po pewnym czasie od chwili jego zbioru. Sporządzenie diagnozy fitopatologicznej zwykle wymaga przeprowadzenia obserwacji mikroskopowych. Obserwacje takie są możliwe, gdy preparat mikroskopowy sporządzony z badanego materiału zielnikowego jest:

1.
Wystarczająco przezroczysty.
2.
Dostatecznie kontrastowy na tle otoczenia.
3.
Przygotowany w sposób umożliwiający jego łatwe umieszczenie w polu widzenia mikroskopu.

Stąd badanie fragmentu porażonej rośliny zwykle jest poprzedzone jego:

1.
Zakonserwowaniem.
2.
Odbarwieniem.
3.
Podzieleniem na skrawki.
4.
Zabarwieniem.
5.
Osadzeniem na mikroskopowym szkiełku przedmiotowym i przykryciem szkiełkiem nakrywkowym.
6.
Zamknięciem preparatu mikroskopowego w celu uzyskania preparatu trwałego.

Konserwacja. Metodę konserwowania materiału zielnikowego przez suszenie przedstawiono na stronie 5. Utrwalanie owoców, bulw, korzeni i innych organów soczystych wykonuje się przez ich zanurzenie w:
  • 92% alkoholu etylowym,
  • 35-40% wodnym roztworze formaliny,
  • FAA (formalina-aceto-alkohol) o składzie:
   
etanol skażony
90 ml
   
kwas octowy lodowaty
5 ml
   
formlina 40%
5 ml
  • 1,5% wodnym roztworze kwasu siarkawego (w szczelnie zamkniętym naczyniu); wcześniej należy materiał zielnikowy utrzymywać w 5% roztworze siarczanu miedzi przez 6 do 20 godzin, po czym wielokrotnie obmyć w bieżącej wodzie wodociągowej,
  • roztworze Heslera zawierającym w 1 litrze wody:
ZnCl2
50 g
formalina 40%
25 ml
gliceryna
25 g

Odbarwianie. Odbarwianie stosuje się w celu usunięcia nadmiaru barwnika utrudniającego obserwacje obiektu w świetle przechodzącym. Materiał odbarwia się przez jego zanurzenie np. w:
  • 70% alkoholu
  • 10% KOH.

W zależności od stopnia zabarwienia i grubości obiektu odbarwianie trwa od jednego do kilku dni. W celu przyśpieszenia tego procesu odbarwiany materiał wraz z użytym środkiem chemicznym utrzymuje się w temperaturze 60-90oC przez 1 h.

Sporządzanie skrawków. Podział obiektu na cienkie skrawki umożliwia jego przestrzenne zbadanie pod mikroskopem w świetle przechodzącym. Skrawki wycina się z badanego materiału ręcznie żyletką lub mikrotomem.

Czynnościami wykonywanymi przy ręcznym krojeniu są:

1.
Ułożenie obiektu na płaskiej powierzchni, mikroskopowym szkiełku przedmiotowym lub szkiełku zegarkowym.
2.
Przytrzymanie obiektu palcem wskazującym lewej ręki w pobliżu miejsca cięcia, tak aby palec był płaszczyzną oparcia żyletki, i wycięcie fragmentu organu rośliny z reprezentatywnymi utworami patogena (krok 1., vide niżej).
3.
Odcinanie możliwie cienkich skrawków z wybranej płaszczyzny obiektu (krok 2.).
4.
 Przeniesienie skrawków do kropli kwasu mlekowego, wody lub innego odczynnika umieszczonego na mikroskopowym szkiełku podstawowym, np. końcem zwilżonej igły preparacyjnej (krok 3.).
5.
 Przykrycie skrawków mikroskopowym szkiełkiem nakrywkowym (krok 4.).

 
Ręczne wykrajanie skrawków

Uzyskiwanie cienkich skrawków znacznie ułatwia krojenie obiektu pod mikroskopem stereoskopowym. Krojenie miękkich i małych obiektów wymaga przytrzymania ich np. w rdzeniu bzu czarnego lub między kawałkami korzenia marchwi.
Ręczne wykrajanie skrawków

Barwienie. Liczne bakterie, organizmy grzybopodobne, grzyby i skrawki roślin są niekontrastowe i stąd trudne do badania pod mikroskopem świetlnym. W celu zwiększenia kontrastu badany obiekt barwi się.

Najczęściej używanymi metodami barwienia są:

1.
Bezpośrednie umieszczenie obiektu łatwo absorbującego barwnik w kropli mieszaniny kwasu mlekowego i barwnika.
2.
Kilkugodzinne lub kilkudniowe przetrzymywanie obiektu trudno się barwiącego w mieszaninie kwasu mlekowego i barwnika.

Używając np. 10% KOH do odbarwiania obiektu, zdolność wiązania barwnika zwiększy się po jego zanurzeniu w 10% HCl, ponieważ odczyn większości barwników jest zasadowy. Barwienie można przyśpieszyć prowadząc ten proces w temperaturze 90oC przez 1 h.

Najpowszechniej używanymi barwnikami są:

1.
Safranina i błękit anilinowy
- wyróżniają ścianę zarodnika, komórki epidermy, ksylem i warstwę korka.
2.
Błękit bawełniany
- wyróżnia zarodniki i strzępki.
3.
Safranina+zieleń trwała
- wyróżniają bakterie i cytoplazmę.
4.
Błękit toluidynowy
- wyróżnia zarodniki, haustoria, ksylem, kutykulę i komórki przyszparkowe.

Osadzanie na szkiełku przedmiotowym i przykrycie szkiełkiem nakrywkowym. Przygotowanie preparatu mikroskopowego obejmuje:

1.
Umieszczenie kropli wody lub używanego roztworu na szkiełku przedmiotowym.
2.
Przeniesienie końcem igły preparacyjnej obiektu i ułożenie go w kropli roztworu w wymaganej pozycji.
3.
Przykrycie obiektu szkiełkiem nakrywkowym przez oparcie jednego z jego boków na płaszczyźnie szkiełka przedmiotowego i wolne opuszczenie szkiełka nakrywkowego na badany obiekt.
4.
Utrwalenie obiektu i usunięcie powietrza przez podgrzanie użytego roztworu wskutek przytrzymania dolnej powierzchni mikroskopowego szkiełka podstawowego nad płomieniem (nie w płomieniu!!!) palnika lub inkubowania preparatu w cieplarce przy 65oC przez 12-24 h.
5.
 Wprowadzenie danych identyfikacyjnych.

 
Preparat diagnostyczny

Utrwalenie preparatu. W celu utrwalenia preparatu badanego obiektu albo umieszcza się go w środkach zamykających, lub szkiełko nakrywkowe preparatu utworzonego na bazie np. kwasu mlekowego otacza się lakierem. Jednym z powszechnie stosowanych środków zamykających jest mieszanina wody destylowanej, alkoholu poliwinylowego, kwasu mlekowego i gliceryny, którą przygotowuje się w następujących proporcjach:

woda destylowana
100 ml
kwas mlekowy
100 ml
gliceryna
10 ml
alkohol poliwinylowy
16,6 g.